迷路

2022/01/27から白文鳥・メス・8歳(今は9歳)が行方不明で探しています。

2022/02/25、ファイザーのコロワクの細胞内逆転写

 


 

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2022/02/25

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ファイザー BioNTech COVID-19 mRNA ワクチン BNT162b2 インビトロヒト肝細胞株の細胞内逆転写

 

 

 

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要約
ファイザーとBioNTechが開発したCOVID-19 mRNAワクチンBNT162b2の前臨床試験では、BNT162b2注射を受けた動物において可逆的な肝効果が示されました。さらに、最近の研究では、SARS-CoV-2 RNAを逆転写してヒト細胞のゲノムに組み込むことができることが示されました。本研究では、ヒト肝細胞株Huh7に対するBNT162b2の影響をインビトロで調べた。Huh7細胞をBNT162b2に曝露し、細胞から抽出したRNAについて定量PCRを行った。我々は、Huh7細胞において高レベルのBNT162b2と、内因性逆転写酵素である長期間散在する核エレメント-1(LINE-1)の遺伝子発現の変化を検出した。BNT162b2で処理したHuh7細胞上のLINE-1オープンリーディングフレーム-1 RNA結合タンパク質(ORFp1)に結合する抗体を用いた免疫組織化学は、LINE-1の核分布の増加を示した。BNT162b2に曝露されたHuh7細胞のゲノムDNA上のPCRは、BNT162b2に特有のDNA配列を増幅した。我々の結果は、ヒト肝細胞株Huh7へのBNT162b2の迅速な取り込みを示し、LINE-1の発現および分布の変化をもたらす。我々はまた、BNT162b2 mRNAがBNT162b2曝露時に6時間という速さで細胞内にDNAに逆転写されることも示している。
キーワード: COVID-19 mRNAワクチン;BNT162b2;肝臓;逆転写;ライン-1;ハッ7

 

1. はじめに
重症急性呼吸器症候群によるコロナウイルス病2019(COVID-19) コロナウイルス2(SARS-CoV-2)は、2020年3月11日に世界保健機関(WHO)から世界的なパンデミックとして発表され、壊滅的な健康危機として浮上しました。2022年2月現在、COVID-19は世界中で4億3,000万人以上の感染例と590万人の死亡をもたらしました[1]。COVID-19に関連する罹患率と死亡率を減らすために、効果的で安全なワクチンが緊急に必要です。


COVID-19に対するいくつかのワクチンが開発されており、特にmRNAワクチン(ファイザー・バイオNTechとモデルナによる)、複製欠損組換えアデノウイルスベクターワクチン(ヤンセンジョンソン・エンド・ジョンソン、アストラ・ゼネカ、スプートニク-V、およびCanSinoによる)、および不活化ワクチン(Sinopharm、Bharat BiotechおよびSinovacによる)に焦点を当てています。mRNAワクチンは、免疫原の設計と製造において柔軟かつ効率的であるという利点を有し、現在、多数のワクチン候補が開発および適用の様々な段階にある。具体的には、ファイザーとBioNTechが開発したCOVID-19 mRNAワクチンBNT162b2は、成功した臨床試験で評価され[2,3,4]、世界中のさまざまな地域での全国的なCOVID-19ワクチン接種キャンペーンで投与されています[5,6,7,8]。

 

BNT162b2は脂質ナノ粒子(LNP)を封入したヌクレオシド修飾RNAワクチン(modRNA)であり、SARS-CoV-2スパイク(S)タンパク質の全長をコードし、抗原的に最適な融合前立体構造を確保するために2つのプロリン変異によって修飾され、無傷のウイルスを模倣してウイルス中和抗体を誘導する[3]。無作為化臨床試験と一致して、BNT162b2は現実世界の設定で広範囲のCOVID-19関連転帰において高い効率を示しました[5]。それにもかかわらず、ワクチンの長期的な安全性と有効性のモニタリングなど、多くの課題が残っています。これはさらなる評価と調査が必要です。BNT162b2の安全性プロファイルは、現在、短期臨床試験からのみ入手可能です。BNT162b2のあまり一般的でない有害作用は、心膜炎、不整脈深部静脈血栓症肺塞栓症心筋梗塞、頭蓋内出血、および血小板減少症を含む報告されている[4,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20]。他の種類のワクチンで観察された有害作用を報告する研究もあります[21,22,23,24]。ワクチン関連の副作用の根底にあるメカニズムをよりよく理解するためには、臨床研究や細胞および分子分析が必要です。

 

最近の研究では、SARS-CoV-2 RNAが逆転写され、ヒト細胞のゲノムに組み込まれることが示されました[25]。これは、部分的なSARS-CoV-2 RNAをコードするBNT162b2でもこれが起こり得るかどうかという疑問を生じさせる。ファイザーが欧州医薬品庁(EMA)に提供した薬物動態データにおいて、BNT162b2生体分布は、放射性標識LNPおよびルシフェラーゼmodRNAによる筋肉内注射によるマウスおよびラットにおいて研究された。放射能は最初の時点(0.25時間)からほとんどの組織で検出され、その結果、注射部位と肝臓が主要な分布部位であり、最大濃度は投与後8〜48時間で観察された[26]。さらに、BNT162b2注射を受けた動物では、肝臓の拡大、空胞化、ガンマグルタミルトランスフェラーゼ(γGT)レベルの上昇、アスパラギン酸トランスアミナーゼ(AST)およびアルカリホスファターゼ(ALP)のレベルの増加など、可逆的な肝効果が観察された[26]。LNP送達系によって誘導される一過性の肝作用は以前に報告されており[27,28,29,30]、それにもかかわらず、modRNAのみを有さない空のLNPは有意な肝障害を引き起こさないことも示されている[27]。そこで本研究では、BNT162b2がヒト肝細胞株に及ぼす影響をin vitroで調べ、BNT162b2が内因性のメカニズムによってDNAに逆転写できるかどうかを調べることを目的とする。

 

2. 材料と方法
2.1. 細胞培養
Huh7細胞(JCRBセルバンク、大阪、日本)を5%COで37°Cで培養した2DMEM培地(HyClone、HYCLSH30243.01)に10%(v/v)ウシ胎児血清(シグマアルドリッチ、F7524-500ML、マサチューセッツ州バーリントン、米国)および1%(v/v)ペニシリン-ストレプトマイシン(HyClone、SV30010、ローガン、ユタ州、米国)を添加した。BNT162b2処理のために、Huh7細胞を24ウェルプレートに200,000細胞/ウェルの密度で播種した。BNT162b2 mRNAワクチン(ファイザー BioNTech、ニューヨーク、ニューヨーク、米国)を、製造業者のガイドラインに記載されているように、滅菌0.9%塩化ナトリウム注射、USPで最終濃度100μg/mLに希釈した[31]。次いで、BNT162b2懸濁液を細胞培養培地に添加して、最終濃度0.5、1.0、または2.0μg/mLに達した。Huh7細胞をBNT162b2の有無にかかわらず6、24、および48時間インキュベートした。細胞をPBSで十分に洗浄し、トリプシン処理によって回収し、さらに使用するまで−80°Cで保存した。

 

2.2. リアルタイム RT-QPCR

 

細胞からのRNAを、製造業者のプロトコールに従ってRNeasy Plusミニキット(キアゲン、74134、ヒルデン、ドイツ)で抽出した。RT-PCRは、メーカーのプロトコールに従って、RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit(Thermo Fisher Scientific, K1622, Waltham, MA, USA)を用いて実施した。リアルタイム qPCR は、BNT162b2、LINE-1、ハウスキーピング遺伝子 ACTB および GAPDH のプライマーと共に、Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific, K0222, Waltham, MA, USA) を用いて実施しました (表 1)。